Zebrafisken er et vigtigt forsøgsdyr

Mennesker og zebrafisk har mere til fælles, end man lige skulle tro. Derfor bruges zebrafisk i stigende grad til blandt andet at undersøge funktionen af gener, til at lave dyremodeller for menneskets sygdomme og til at udvikle ny medicin til mennesker.

03.03.2017 | Lisbeth Heilesen

Voksne zebrafisk i zebrafiskefaciliteten på Institut for Molekylærbiologi og Genetik, Aarhus Universitet. Zebrafisk lever vildt i det nordøstlige Indien, Bangladesh og Nepal i stillestående og langsomt strømmende vand i grøfter, rismarker og vandhuller. Det latinske navn Danio skulle efter sigende komme af dhani, som er bengalsk for "fra rismarken". Foto: Lisbeth Heilesen.

Zebrafiskefaciliteten ved Institut for Molekylærbiologi og Genetik, Aarhus Universitet - Zebrafisk fylder mindre på reolerne end mus. Foto: Kasper Kjær-Sørensen. Klik billederne for større udgave.

Zebrafiskens embryoner er gennemsigtige. Her ses et 24 timer gammelt embryon som det ser ud i et almindeligt lysmikroskop. Udover udvendige strukturer som blommesæk, hoved og øje ses blandt andet hjernedele, det indre øre og de V-formede somitter, der er forstadier til den V-formede skeletmuskulatur. Foto: Kasper Kjær-Sørensen.

Transgent 72 timer gammelt embryon med grønt fluorescerende protein (GFP) i endothelcellerne i blod-og lymfekar. Alle kar fremhæves tydeligt i den levende organisme. Bemærk, at på grund af den store tæthed af kar omkring gællerne, fremstår undersiden af hovedet overeksponeret på billedet. Foto: Kasper Kjær-Sørensen.

Mikroinjektion i nybefrugtede embryoner. De viste embryoner er godt 30 minutter gamle og ligger i hver sin fosterhinde (chorion). Den første celle er ved at blive dannet og kan eksempelvis ses nederst i embryonet øverst i billedet. Foto: Kasper Kjær-Sørensen.

Det kan ved første øjekast undre, at en almindelig dansk akvariefisk er blevet forskernes nye favorit. Ikke desto mindre er det tilfældet for den lille zebrafisk (Danio rerio), som i disse år anvendes til at undersøge funktionen af gener, til at lave dyremodeller for menneskets sygdomme og til at udvikle ny medicin til mennesker. Vi har meget mere tilfælles med zebrafisken, end man umiddelbart skulle tro, og zebrafisken er fra naturens hånd udstyret med en række egenskaber, der gør den særdeles velegnet i forskningslaboratoriet.


Zebrafisken ligner mennesket anatomisk og genetisk

Udenpå synes lighederne mellem menneske og zebrafisk begrænsede, men med få undtagelser såsom mælkekirtler, moderkage og lunger findes stort set alle menneskekroppens organer også hos zebrafisken. Organerne består generelt af de samme celletyper som hos os, og i cellerne er det i stor udstrækning de samme gener, der dikterer identitet og funktion. For 71 procent af alle menneskets gener er der identificeret tilsvarende zebrafiskegener, og ser man på humane gener, der er associeret med sygdomme, er andelen helt oppe i nærheden af 80 procent. Ikke overraskende ligner musen os mere, idet der findes muse-versioner af 83 procent af menneskets gener, mens der hos høns findes 64 procent.


Praktiske egenskaber hos zebrafisken

Nogle af de egenskaber, der gør zebrafisken velegnet som dyremodel, er dens høje frugtbarhed, lynhurtige embryonaludvikling uden for moderfisken, og at embryonet er gennemsigtigt, således at celleudviklingen kan undersøges udefra. Under forudsætning af optimal miljøstyring, vandkvalitet og sundhedstilstand kan et enkelt zebrafiskepar producere 200 befrugtede æg ved blot en enkelt ugentlig krydsning, som i øvrigt kan foregå uden pauser året rundt.

I dagene op til krydsningen holdes hunner og hanner separeret. Når så kønnene lukkes sammen, gyder hunnerne inden for cirka ti minutter, og hannerne befrugter straks samtlige æg. At zebrafiskens æg befrugtes uden for moderen og at embryonet forbliver gennemsigtigt i flere dage betyder, at hver enkelt celle kan følges kontinuert i 'real time' ved almindelig lysmikroskopi.

Foruden den embryonale udvikling muliggør gennemsigtigheden også detaljerede studier af de tidlige larvestadier.

Dette er en kæmpe fordel, som betyder, at fænotyper, som muligvis ikke ville være umiddelbart synlige i eksempelvis en mus, kan opdages. Der findes desuden pigmentfrie zebrafiskelinjer, som muliggør lysmikroskopiske undersøgelser af fiskens indre i selv de voksne fisk, selvom størrelsen naturligvis begrænser lysets penetration ind i de dybereliggende væv.

Embryonets gennemsigtighed udnyttes til fulde ved brugen af transgene zebra-fisk, der udtrykker fluorescerende markører i specifikke væv og celletyper eller som respons på aktivering af specifikke molekylære signaleringsveje. Der findes tusindvis af sådanne transgene zebrafiskelinjer, hvor eksempelvis endothelceller, en specifik gruppe af neuroner eller specifikke blodceller udtrykker et fluorescerende markørprotein og dermed på dramatisk vis fremhæver fænotyper i netop disse væv og celler i den levende organisme.


Manipulation af genfunktion i zebrafisk

For at undersøge funktionen af et gen manipulerer man med aktiviteten af genet eller dets produkter (RNA, protein). Med den tilgængelige teknologi i zebrafisk er det muligt både at slukke eller skrue ned for et specifikt gen, at skrue op for genet eller endog introducere fremmede gener.

Det er også muligt at lave specifikke mutationer og andre ændringer i genomet præcist, hvor man ønsker det.

Dette kan gøres ved mikroinjektion af RNA eller DNA i det befrugtede æg inden for den første time. En enkelt person kan injicere 500 befrugtede æg inden for dette tidsrum, og zebrafisken som dyremodel giver derfor mulighed for at opnå ganske store datasæt fra et enkelt eksperiment.

Grundet fosterets gennemsigtighed og tidligere teknologiske begrænsninger er megen forskning i zebrafisk baseret på undersøgelser og manipulation af genudtryk i de tidlige fosterstadier.

Med CRISPR/ Cas9-teknologien, der har vundet stor udbredelse og som muliggør specifik genomisk editering, kan vi forvente en stigende brug af også ældre larver, ungfisk og voksne fisk.


Zebrafisk i klinisk forskning

Udover grundforskning i funktionen af gener og i udviklingsbiologi bruges zebrafisk blandt andet til at studere den genetiske basis for en bred vifte af humane sygdomme - eksempelvis hjertearytmier, neurodegenerative sygdomme, endokrinologiske lidelser og hæmatologiske sygdomme. Måske lidt mere overraskende anvendes zebrafisken også i studier af den genetiske og neurologiske basis for depression, narkotika-afhængighed og indlæring.

Hertil kommer, at zebrafisken er på vej til at blive et gennemgående forsøgsdyr i studier, hvor store biblioteker af lavmolekylære stoffer screenes for medicinske egenskaber imod specifikke sygdomme eller sygdomsprocesser. Eksempelvis har en sådan 'small molecule drug screening' i zebrafisk ført til opdagelsen af prostaglandin E2 (PGE2) som en potent fremmer af dannelsen af hæmotopoietiske stamceller, hvilket har stor terapeutisk relevans i forbindelse med knoglemarvstransplantationer.


Screening af nye lægemidler

En væsentlig årsag til zebrafiskens anvendelse i drugscreening er embryonernes tilgængelighed og størrelse, og at embryonerne kan optage teststofferne direkte fra vandet. Den begrænsede størrelse betyder nemlig, at embryoner kan holdes i meget små voluminer, sågar i 96-eller 384-huls ELISA-bakker.

Derfor kan store biblioteker af teststoffer screenes i en levende organisme i et meget håndterbart format, og forbruget af de ofte kostbare teststoffer er minimalt.

Som eksempel er det således muligt at identificere teststoffer, der kan hæmme transmission i neuromuskulære synapser eller blokere for angiogenesen.

Evalueringen af effekterne kan i begge eksempler delvist automatiseres: Effekten på den neuromuskulære transmission kan i en simpel screening kvantificeres indirekte ved videobaseret analyse af embryonernes bevægelse. Angiogenese kan kvantificeres ved at anvende transgene embryoner med en fluorescerende markør i endothelcellerne og eksponere embryonerne for teststofferne i en ELISA-bakke, hvor fluorescens efterfølgende måles med en plate reader.

Identificerede kandidater kan herefter underkastes en mere grundig visuel inspektion af de påvirkede embryoner.


Toksikologiske undersøgelser

Ved at screene nye lægemidler i en levende organisme får man udover information om de farmakologiske effekter vigtig viden om eventuelle giftvirkninger: Overlever embryonerne, påvirkes hjertefunktionen, induceres levernekrose eller påvirkes respirationen? Sådan information opnås ikke i forsøg med kultiverede celler, og informationen er væsentligt dyrere og ofte mere kompliceret at opnå i pattedyr. Derfor udgør zebrafisken et oplagt supplement, hvor giftvirkningerne undersøges i zebrafiskeembryoner, før de testes videre i gnavere og større pattedyr.


Studier af embryonale gener

Som eksemplificeret ved brugen af zebrafisk til at modellere human sygdom kan data fra zebrafisk alene være af høj kvalitet og relevans. Zebrafisk har endvidere en særlig fordel i detaljerede studier af gener, som man ikke har kunnet studere i mus eller andre pattedyr, fordi ændringer i disse gener har vist sig embryonalt letale. På grund af zebrafiske-embryonets tilgængelighed allerede fra befrugtningen er det også for disse gener muligt at studere, hvad der går galt i hvilke celler hvornår, og samtidig udføre analyser for interaktioner med andre gener.


Zebrafisken som supplement til andre forsøgsorganismer

Zebrafisken har ligeledes stor forskningsmæssig værdi som supplement til andre modelorganismer. Som eksempel på en gavnlig synergi kan zebrafisken bruges til forholdsvist hurtigt, billigt og med høj opløsning at screene for fænotypiske ændringer som følger af specifik genetisk manipulation. Disse data kan efterfølgende bruges til at guide fænotypingen af mus med den samme genændring, og på den måde kan zebrafisken være et springbræt til senere forsøg på pattedyr.

Det har således været muligt at identificere fænotyper i zebrafisk, som ellers var blevet overset i mus. Omvendt kan data fra mus også efterfølges af højopløste real-time analyser af dynamiske processer i zebrafisk som eksempelvis cellemigration, angiogenese eller axonal udvækst. Nogle af zebrafiskens fordele kan også opnås ved brug af rundorme (C. elegans) og bananfluer (D. melanogaster), hvor forsøgene tillige kan udføres endnu hurtigere og billigere end i zebrafisk. Men da disse hvirvelløse organismer evolutionært er væsentligt længere fra mennesker end zebrafisken er, er de genetiske, anatomiske og fysiologiske forskelle fra mennesket også væsentligt større. Zebrafisken udgør derfor i mange tilfælde et godt kompromis mellem de dyrere mus og de billigere rundorme og insekter.


Opstaldning af zebrafisk

Da zebrafisk er en stimefisk, holdes de som udgangspunkt i flokke med en anbefalet tæthed på op til fem voksne fisk per liter. Det tillader, at de kan udleve deres naturlige flokadfærd. I standard-konfiguration af et standard kommercielt akvariesystem til zebrafisk er der kapacitet til over 900 voksne fisk på et areal svarende til en standard muse-reol med plads til 75-150 mus.

Dette er medvirkende til at gøre zebrafisk relativt billige at arbejde med, hvorved der kan opnås mere forskning for færre midler.


Zebrafiskens embryonale udvikling

Zebrafiskens embryonale udvikling er ekstremt hurtig:ca. 3 timer efter befrugtningen har fosteret 1.000 celler, ca. 18 timer efter befrugtningen begynder fosteret at bevæge sig, og ca. 22 timer efter befrugtningen slår hjertet.


Mere information

Kasper Kjær-Sørensen, ph.d.
Institut for Molekylærbiologi og Genetik
Aarhus Universitet
kks@mbg.au.dk - 5144 6497

Claus Oxvig, professor
Institut for Molekylærbiologi og Genetik
Aarhus Universitet
co@mbg.au.dk - 3036 2460

Aage Kristian Olsen Alstrup, ph.d., dyrlæge
Institut for Klinisk Medicin, PET-Centret, forskningsafdeling
Aarhus Universitet
aage.olsen@clin.au.dk - 78464396

Denne artikel er publiceret i Dyrlægen d. 27. februar 2017, pp. 26-30, og er gengivet her efter tilladelse fra redaktøren af Dyrlægen.

Forskning