Ny proteomikstrategi afslører skjulte signaleringsnetværk for ADP-ribosylering

ADP-ribosylering er en proteinmodifikation, der regulerer en lang række cellulære processer, herunder DNA-reparation, stressrespons, metabolisme og immunsignalering. Selvom modifikationen blev opdaget for mere end 60 år siden, er der stadig grundlæggende spørgsmål om, hvor og hvordan den forekommer inde i cellerne.

En af årsagerne er teknisk. Visse former for ADP-ribosylering er meget ustabile og kan forsvinde under almindelige laboratorie-workflows, før de kan påvises med massespektrometri.

I et nyt studie publiceret i Nature Communications har forskere fra Nielsen-laboratoriet ved Institut for Molekylærbiologi og Genetik, Aarhus Universitet, sammen med samarbejdspartnere fra University of Oxford, University of Texas Southwestern Medical Center, RWTH Aachen University og Københavns Universitet, adresseret denne udfordring ved at forfine en af de mest anvendte proteomikmetoder til at studere ADP-ribosylering.

En mangeårig udfordring i feltet

I løbet af det seneste årti har massespektrometribaseret proteomik forandret studiet af ADP-ribosylering og gjort det muligt at identificere tusindvis af modifikationssteder på tværs af proteomet. De fleste studier har dog fokuseret på relativt stabile former for modifikationer.

Andre forskere har tidligere vist, at ADP-ribosylering bundet til glutamat- og aspartatrester er særligt følsom over for almindelige betingelser ved prøveforberedelse. Derfor har disse modifikationer været vanskelige at studere systematisk og har sandsynligvis været underrepræsenteret i eksisterende datasæt.

“ADP-ribosylering er en meget dynamisk modifikation, og nogle former er overraskende skrøbelige,” siger professor Michael L. Nielsen, seniorforfatter på studiet. “Vi ville forstå, hvorfor disse modifikationer gik tabt, og om vi kunne tilpasse vores eksisterende proteomikplatform, så de blev bevaret.”

Holdet undersøgte systematisk, hvordan forskellige betingelser for prøveforberedelse påvirker stabiliteten af ADP-ribosylering, og identificerede centrale trin, der fører til tab af glutamat- og aspartatbundne modifikationer.

Udvider mulighederne i en udbredt proteomikplatform

Forskerne forfinede derefter deres Af1521-baserede enrichment-workflow, en strategi der er blevet en hjørnestensteknologi til storskala-analyse af ADP-ribosylering.

Ved at kombinere sure betingelser under prøveforberedelsen med en modificeret version af Af1521-enrichment-reagenset kunne forskerne bevare og identificere labile ADP-ribosyleringshændelser, som tidligere var vanskelige at påvise med dette workflow.

“Dette arbejde viser, at Af1521-platformen kan indfange et langt bredere spektrum af ADP-ribosyleringsbiologi, end man hidtil har været klar over,” siger Michael L. Nielsen. “Det gør det muligt for os at undersøge modifikationshændelser, som i høj grad har været skjult i konventionelle analyser.”

Afslører cytokindrevede signaleringsnetværk

For at demonstrere metodens biologiske potentiale anvendte forskerne workflowet til at studere cytokinsignaleringsveje.

Analyserne afdækkede hundredvis af glutamat- og aspartatbundne ADP-ribosyleringssteder på tværs af cellulære proteiner involveret i immunregulering og antivirale responser. Studiet viste, at disse modifikationer fortrinsvis rammer cytoplasmatiske signaleringsnetværk og udviser forskellige mønstre afhængigt af celletype og cytokinstimulering.

Forskerne identificerede også omfattende ADP-ribosylering forbundet med interferonsignaleringsveje og fandt evidens, der kobler ADP-ribosylering til ubiquitinafhængige regulatoriske processer.

Tilsammen udgør resultaterne en af de hidtil mest omfattende ressourcer til at studere glutamat- og aspartatbundet ADP-ribosylering og giver ny indsigt i, hvordan celler reagerer på inflammatoriske og antivirale signaler.

Åbner nye muligheder for forskning i ADP-ribosylering

Forskerne mener, at studiet vil bidrage til at accelerere arbejdet med at forstå de biologiske funktioner af forskellige typer ADP-ribosyleringsbindinger og deres roller i sundhed og sygdom.

“I mange år har forskere diskuteret, hvilke aminosyrer der modificeres ved ADP-ribosylering under forskellige biologiske betingelser,” siger Michael L. Nielsen. “Ved at forbedre vores mulighed for direkte at observere disse svært påviselige modifikationer i celler kan vi begynde at besvare nogle af de grundlæggende spørgsmål og få et mere komplet billede af ADP-ribosyleringssignalering.”